胆管周围腺（PeribiliaryGlands，PBG）是祖细胞的来源之一，环绕着大胆管排列。严重的胆管病变伴管腔胆管上皮的丧失被认为可以激活PBG，进而引起细胞增殖和分化以恢复胆管上皮的完整性。本实验用从废弃的供体肝脏中获取的肝外胆管切片建立离体模型，研究严重胆道损伤后PBG细胞的分化和迁移。
缺血后胆管切片在含氧培养基中培养一周后，可观察到严重的组织损伤，包括管腔上皮消失，壁间质坏死。与此相反，PBG相对完好，并观察到PBG的不同反应，包括PBG扩张、细胞增殖和成熟。PBG细胞在富氧培养24小时后增殖明显增强，72小时达到高峰。PBG细胞增殖的同时，PBG细胞凋亡减少，从原始和多潜能（homeoboxproteinNanog+/sex-determiningregionY-box9+）分化为成熟（cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator+/secretinreceptor+）和激活表型（HIF-1、
glucosetransporter1和VEGF表达增加）。在体外模型中，增殖的PBG细胞是结构散乱的，但是在基质表面产生了单层上皮。结论：PBG中含有胆管前体细胞，能够在胆管上皮细胞的损伤的情况下作出反应，通过增殖、分化、成熟恢复上皮完整性。PBG在严重损伤后的胆管再生中起到重要的作用。
大的肝内外胆管的胆管周围腺体（PBG）是一个由相互连接的腺泡和导管组成的三维网状结构，流入胆管腔。PBG已被证明包含具有多潜能特性的细胞，即典型的干/祖细胞。PBG在损伤后被激活，并由特定分子和信号通路驱动，以恢复受损胆管上皮的完整性。
到目前为止，已经在肝胆管结石、原发性硬化性胆管炎和移植后胆管疾病患者中观察到PBG的激活。目前对PBG及其在病理状态下的行为是基于现况、动物研究和细胞培养的研究，这些模型还没有提供明确的证据能证明在胆管严重损伤后PBG对于胆管上皮功能和形态的恢复的作用。由于缺乏研究人PBG细胞增殖、迁移和成熟的实验模型，进一步研究PBG在病理条件下的相互作用受到阻碍。
本研究的目的是开发一种体外人体模型，以重现人胆管内PBG的改变，从而对PBG在损伤后再生过程中的增殖、成熟和迁移进行研究。另外，此研究用这个模型单独来探讨PBG细胞在肝移植术后胆管恢复中的作用。
胆管组织取自未能进行移植的16个成人供肝。所有的肝脏都采用标准的原位冷却技术，并用冷UW保存液冲洗。术中结扎胆囊管，用保存液逆行冲洗胆管。肝脏用静态冷保存（SCS）运送。
方法
切片进行苏木精和伊红染色，用于组织学评估。
免疫组化进行了上皮细胞粘附分子（epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM）和钙视网膜蛋白（calretinin）、vWF、细胞角蛋白19（CK19）、Ki-67的染色。用Ki-67染色法测定各载玻片的增殖指数。所有的PBG细胞进行人工计数。增殖指数为Ki-67阳性PBG细胞/所有PBG细胞。
免疫荧光检测VEGFR2。PCNA/cleavedcaspase-3双染。
qPCR检测
结果
一、胆管切片缺血复氧后PBG与基质损伤
胆管的组织学显示严重的组织损伤，胆管管腔上皮完全丧失，壁间质坏死。相比之下，PBG细胞相对较好，细胞死亡的迹象较少。培养过程中PBG的形态从保存良好的细胞和组织结构到细胞的完全破坏，空腺泡和细胞碎片聚集，表明这是一个坏死过程。在同一切片中，一些PBG显示扩张，伴或不伴PBG坏死。
在PBG和周围的基质细胞中都发现了裂解的caspase-3表达的免疫组化证据，表明凋亡细胞死亡的激活。氧合培养后，在72和小时PBG细胞中裂解的caspase-3表达显著降低。在基线检测后，活PBG细胞的百分比略有增加，并在小时的孵育期间保持在50%左右。相反，在小时的培养过程中，活的表面上皮细胞的百分比从0%增加到32%。一些PBG被α-SMA阳性（desmin和caldesmon阴性）肌成纤维细胞组成的间质组织包围。血管性血友病因子（vWF）免疫组化显示导管壁间质内和PBG附近有血管存在。一些血管显示出损伤迹象，表现为内皮细胞扩张和丢失。一般来说，胆管切片中存在间质细胞（肌成纤维细胞和血管）表明其解剖结构几乎完好无损。
此外，PBG对缺氧条件的反应通过缺血后恢复性反应（即缺氧诱导因子1α[HIF-1α]、葡萄糖转运蛋白1（Glut-1）和VEGF-a）的表达研究。PBG显示缺氧标记物HIF-1α（在核水平）、Glut-1和VEGF-a的表达随时间的推移而增加，因此提示HIF依赖性和促血管生成途径的激活。PBG对VEGFR-1和R-2呈阳性，这表明其对邻近的VEGFR-2+（CD31+）内皮细胞有自分泌作用和旁分泌刺激。
二、PBG细胞的增殖与上皮单层的再生有关
Ki-67的免疫组化显示，在基线时没有增殖的PBG细胞，在培养期间，PBG内观察到大量增殖细胞。通过计算增殖指数来量化PBG的增殖程度。复氧后24小时内出现增殖细胞，此后增殖指数增加，富氧72h达高峰，然后逐渐衰落。从48小时开始，增殖指数明显高于基线水平。
同时，在小时后观察到CK19阳性上皮的再生，CK19表达的定量显示出类似于PBG增殖指数的模式，表明由于PBG细胞增殖，胆管上皮细胞数量增加。
此外，在培养小时后，在切片内的开放空间形成了靠近PBG集合的上皮单层，这表明增殖的PBG细胞迁移到遇到的任何组织表面形成上皮层。
在培养72小时后，在切片的管腔侧和基底外侧出现新形成的单层上皮，这一现象支持这一观点，新形成的上皮由PBG驱动，在整个组织切片的多个侧面恢复无上皮覆盖的表面。为了证实基底外侧新形成的单层是上皮细胞而不是间皮，对切片进行了EpCAM和calretinin染色，这两种物质分别对上皮和间皮有特异性。所有基质表面的单层膜均为EpCAM阳性，calretinin阴性，证实了组织中上皮细胞的再生。总的来说，这些发现表明缺血和随后的复氧诱导胆管上皮细胞严重损伤，但残留的PBG细胞能够增殖并补充丢失的细胞。
三、增殖和再生过程中PBG表型的变化
一般来说，30%-50%的PBG在所有时间点都含有SOX9表达细胞，即内胚层祖细胞表型。为了探索增殖和迁移的PBG细胞的成熟，我们进行了实时定量PCR，以评估同源盒蛋白Nanog（一种与未分化干细胞自我更新密切相关的转录因子）的mRNA表达，以及囊性纤维化跨膜传导调节器（cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR）的mRNA表达，这是一种成熟胆管细胞特有的转运体。Nanog基因表达随着时间的推移而下降，在小时的充氧培养中显著降低。免疫组织化学也证实PBG内存在细胞核Nanog阳性细胞。与Nanog相比，CFTR基因的相对表达随着时间的推移而增加，并且在小时时水平显著高于基线水平（P=0.）。因此，CFTR和Nanog基因表达之间的比率随着时间的推移而增加，表明从原始表型、多潜能表型到成熟表型的全面分化（图7D）。与基线相比，在72小时和小时，CFTR基因表达的增加与CFTR逐渐扩大的顶端免疫荧光染色平行（图7C）。
分泌素受体（secretinreceptor，Sec-R）的表达证实了增殖的多能性PBG细胞向成熟的成体胆管细胞转换，其主要出现在小时后（图7E）。
在24小时内，Nanog和CFTR的表达发生了明显的变化，这与Ki-67表达所证明的PBG增殖的开始相吻合（图5A）。此外，在体外模型中研究了辐射状PBG的保存。深部和淋巴管周围的PBG表现为Sox9和PCNA表达（图8A）。与位于腔上皮连续的外淋巴结相比，位于较深位置的PBG表现为Sox9和PCNA的高表达。管腔上皮细胞几乎呈Sox9-型，无增殖型PCNA+细胞。此外，与Sox9-PBG细胞相比，Sox9+PBG细胞的增殖指数（即PCNA阳性率的百分比；图8B）和cleavedcaspase-3表达较低（图8C），因此表明祖细胞受凋亡影响的可能性较小。
预览时标签不可点
联系电话：