研究背景：
梗阻性胆汁淤积症是由胆总管或其支流阻塞引起的，炎症被认为是胆道梗阻导致胆汁淤积性肝损伤的原因之一。实验研究已经确定，在胆道梗阻的动物模型中，内毒素或脂多糖治疗后，细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生增加，从而启动了促炎反应。TLR4被认为是革兰氏阴性细菌内毒素或LPS的受体，并参与炎症信号反应。TLR4在包括肝脏Kupffer细胞在内的多种细胞中表达。LPS激活细胞表面的TLR4导致MAPK信号蛋白的激活，NF-κB移位到细胞核导致编码炎症相关分子和细胞因子的基因转录，包括TNF-α和IL-6。阻断TLR4可减少伴有细菌感染的胆道梗阻对肝脏的损害。此外，促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6，在动物模型中减少胆汁流量，进一步导致胆汁淤积，这也可能加重炎症。DA（14-脱氧-11，12-二氢穿心莲内酯，C20H28O4）是从穿心莲中分离得到的一种二萜化合物，具有抗炎、抗血小板和降压等药理作用。DA对脂多糖刺激的RAW.7细胞NF-κB依赖的反式激活有抑制作用。
结果1DA改善LPS，BDL对小鼠肝损伤的影响
如图1A所示，6h后，BDL组小鼠血清总胆红素(TBIL)水平明显高于假手术组(P0.01)，表明该模型成功地诱导了小鼠明显的淤积性肝损伤。在BDL小鼠中，TBIL水平在LPS注射后6小时没有继续增加，但ALT水平以时间依赖的方式进一步增加(图1A)。图1B显示了DA的化学结构。25和50mg/kg的DA可显著降低假手术和BDL小鼠的TBIL和ALT水平，与急性毒性实验所得的浓度相比，差异有统计学意义(P0.05)，表明DA能显著降低LPS诱导的TBIL和AL-T的水平(P0.05)。应用25mg/kg多巴胺后，血清总胆红素水平虽略有下降，但差异无统计学意义(p0.05)。
结果2DA可延长LPS诱导的BDL小鼠的存活时间
给BDL小鼠注射LPS，剂量为1μg/g体重。在没有DA预处理的情况下，BDL小鼠在LPS注射后变得生病、昏昏欲睡，缺乏力量和协调性。但DA处理可显著提高BDL小鼠的存活率(p0.05)。此外，DA处理的BDL小鼠的存活率显著提高，在LPS注射后存活率为73%，而PBS处理的BDL和LPS处理的BDL小鼠存活率分别为41%(图2)。结果提示，DA治疗不仅能保护肝脏免受胆汁淤积损伤，而且能延长LPS诱导的BDL小鼠的存活时间。
结果3DA可抑制LPS诱导的BDL小鼠促炎细胞因子的产生
酶联免疫吸附试验(ELISA)显示，LPSDA50mg/kg和LPS(1μg/g体重)对BDL小鼠肝组织(A)和血浆(B)中TNF-α和IL-6的分泌均有抑制作用。
结果4DA治疗抑制LPS小鼠BDL纤维化形成
炎症可诱导kupffer细胞活化，产生转化生长因子β1，并可激活纤维化肝星状细胞。我们评估DA治疗是否会影响肝脏促纤维化基因的表达。定量PCR结果显示，肝纤维化过程中转化生长因子-β-1基因的表达在内毒素诱导的DA-BDL小鼠中显著低于BDL小鼠(图4A，P0.01)。免疫组织化学分析还显示，与脂多糖干预后的DA-BDL小鼠相比，DA-BDL小鼠α-SMA蛋白的表达显著降低(图4B，p0.01)。肝切片Masson‘s染色分析也支持这一结果，与LPS组相比，LPS组DA-BDL小鼠肝门管区胶原纤维增厚减少，纤维间隔不明显(图4C，p0.05)。这些数据表明DA治疗通过抑制炎症抑制Kupffer细胞的激活，进一步减少LPS诱导的BDL小鼠纤维化的形成。
结果5DA可抑制脂多糖刺激的BDL小鼠和原代Kupffer细胞NF-κB的活化。
NF-κB是指在炎症反应中起关键作用的转录因子家族。因此，进一步检测了NF-κB在Kupffer细胞和组织中的表达。经DA处理的BDL小鼠NF-κB含量显著低于未加DA处理的BDL小鼠(图5A和图5B，P0.01)。为了进一步证实这一结果，我们从一只野生型小鼠中分离出原代Kupffer细胞，并与DA在1，2，4μM(LD50=2μM)下孵育。原代Kupffer细胞的高含量细胞成像显示，LPS(1κg/ml)激活NF-κB，DA在所有给定浓度(Thermo，细胞组学A)均可显著抑制NF-κB的激活
结果6DA处理降低了Kupffer细胞与LPS的结合
研究了在原代Kupffer细胞中DA是否抑制LPS与TLR4的结合。LPS是一种众所周知的TLR4配体，可以与宿主细胞膜(如单核细胞和巨噬细胞)上的TLR4复合体结合。这导致了炎症反应的激活，因此利用原代Kupffer细胞进行实验，以评估DA对内毒素与细胞结合的影响。细胞与1、2、4μM的DA、荧光素标记的LPS和抗TLR4抗体共同孵育。用高含量细胞图像分析LPS结合情况。以抗TLR4抗体作为阳性对照。如图6A所示，细胞与抗TLR4抗体孵育，几乎完全阻断了LPS与原代Kupffer细胞的结合，细胞周围几乎没有观察到荧光，而LPS标记的荧光在与LPS孵育的细胞中仅在较长的时间内逐渐增强。然而，在所有实验浓度下，DA均可阻断LPS的结合，2和4μM的DA与LPS相比，差异有统计学意义(P0.05)，仅在Kupffer细胞中有统计学意义。进一步证实DA对LPS诱导的炎性细胞因子的抑制作用
结果7DA可抑制LPS诱导的BDL小鼠原代Kupffer细胞产生炎性细胞因子
观察了DA对LPS诱导的BDL小鼠原代Kupffer细胞和人LX-2细胞产生促炎细胞因子的抑制作用。图7A显示，2μM和4μMDA对BDL-Kupffer细胞和LPS(ng/ml)刺激的BDL-Kupffer细胞产生肿瘤坏死因子-α均有抑制作用(p0.05或p0.01)。2和4μM的DA能有效抑制BDL-Kupffer细胞产生IL-6(p0.05)，而LPS对BDL-Kupffer细胞的抑制作用仅在4μM(图7b，p0.05)。此外，DA在2或4μM时也能显著抑制脂多糖刺激的人LX-2细胞产生肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6(图8，p0.05或p0.01)。这些体外实验结果表明，DA可减轻LPS诱导的原发性Kupffer细胞炎症反应。
结果8DA可抑制LPS诱导的人LX-2细胞产生炎性细胞因子
DA在2或4μM时也能显著抑制脂多糖刺激的人LX-2细胞产生肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6(图8，p0.05或p0.01)。上述体外实验结果提示DA可能通过TLR4减轻LPS诱导的原代Kupffer细胞和肝星状细胞的炎症反应。
讨论：
DA治疗降低了BDL鼠LPS中NF-κB的数量(图5)，同时降低了TNF-α和IL-6的表达。此外，Kupffer细胞表达TLR4，能够对肝脏中极低浓度的脂多糖作出反应，肝脏Kupffer细胞也在炎症中发挥关键作用。脂多糖结合TLR4并转导随后导致炎症反应上调的信号。还清楚地表明，阻断TLR4信号传导或核因子-κB激活可有效减轻胆道梗阻时的肝损害。我们的数据显示，在Kupffer细胞中，在所有给定的浓度下，脂多糖诱导的核因子κB的激活都可以被DA抑制。因此，我们假设DA能阻断原代Kupffer细胞中脂多糖与TLR4的结合，并调节随后导致炎症反应减弱的信号通路。在这项研究中，我们使用高含量细胞成像来证明DA抑制原代Kupffer细胞中LPS和TLR4的结合。此外，我们还发现，通过脂多糖诱导的肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的表达在用DA处理的Kupffer细胞中降低。根据这些数据，DA对促炎细胞因子产生的抑制依赖于原代Kupffer细胞中的TLR4。提示脂多糖诱导的炎症过程中DA、TLR4、核因子-κB、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6之间存在调节关系。DA能降低BDL小鼠或脂多糖处理的原代Kupffer细胞的肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的生成。这种效应是通过阻止脂多糖与TLR4结合以及随后抑制核因子-κB信号通路来介导的。DA可能成为胆道梗阻和严重炎症反应患者的新型治疗药物。
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